#mRNA#

注：本文不构成任何投资意见和建议，以官方/公司公告为准；本文仅作医疗健康相关药物介绍，非治疗方案推荐（若涉及），不代表耀海生物立场。

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前言

mRNA 药物生产大体可以分为两个阶段，前端为mRNA的生产和纯化，后端为利用LNP脂质微粒包封阶段。

上端的生产又涉及 dNa 原液制备和 mRNA 原液的体外转录制备，由此可见，DNA原液制备是整个mRNA药物生产的第一步，那么构建DNA模板就显得尤为重要，在这个过程中质粒作为载体发挥了关键性作用。

质粒的身份

通常每个细胞都有一个细胞核或核区域，包含了细胞的所有遗传物质。

但原核细胞和一些真核细胞，拥有额外的圆形的双链DNA，从核区域的DNA分离，这个额外的DNA就被称为质粒（plasmid）。

细菌质粒是DNA重组技术中常用的载体，即将目的基因序列和质粒整合在一起，构成重组质粒再导入受体细胞(如大肠杆菌)中，使目标基因在受体菌中得以表达，从而产生特定的生理反应。

为何选择质粒作为载体？

质粒的适用范围宽，其不仅可以修饰酵母与细菌等生物，也可以随细胞一同复制，并且具备自复制能力。

获取难度低，质粒容易从宿主细胞中分离。

可以对添加的DNA片段进行标记，有利于鉴别和筛选。

尺寸较小易于操作。

如何读懂质粒图谱?

那在构建一个重组质粒的时候需要设计图谱，但是可能有些实验小白们拿到图谱的时候还是一脸懵圈，所以今天菌菌就用几分钟带各位萌新们读懂质粒图谱。

拿到一个图谱，第一步首先看箭头。

多数质粒图谱上都会有两种箭头标识，解释如下：

一种是由启动子开始的一个大箭头，是启动子启动序列的顺序，代表转录方向；

另一种是复制起始位点的方向，复制起始位点就是该质粒在大肠杆菌等细菌或真菌中DNA复制的一个方向。

了解转录的方向，这样就方便设计插入片段的位置和方向性。

质粒图谱上有的箭头顺时针有的箭头逆时针，是指两条DNA链，即质粒是环状双链DNA，它的启动子等在其中一条链上，而它的抗性基因在另一条链上。

另外，如果有F1启动子的话，代表的是噬菌体的复制起始方向，只能复制出单链的DNA，但可以用来测序。

转录的方向的意义在于方便设计插入片段的位置和方向性。

第二步，看所标示的标签。

从上图的标签中可以得到该质粒的相关信息。

ORI（Origin of replication，ORI）：DNA 复制起始位点，一般在大肠杆菌中是pUC类的。

一个载体只可能存在一个ori，不得改变。

ORI的选择取决于想要维持质粒拷贝的数量、所选择的宿主以及与其他质粒的兼容性。

一般来说，具有相同胞核的质粒是不相容的，因为它们会争夺相同的复制机制，造成不稳定和不可预测的环境。

P（Promoter）：启动子，常见的启动子有：CMV、EF1（启动长片段），H1、U6（启动短片段），35S、2×35S。

以前在【星耀小课堂】服务mRNA技术的质粒发酵工艺应用中提到过启动子和复制起始点的区别，毕竟两个词听起来确实很容易混淆，带大家回顾一下：

复制起始位点ORI针对的是质粒自身复制，它的强度决定质粒在宿主菌中的产量；而Promoter介导的是基因的转录，它决定的是基因的表达能力。

因此我们根据对拷贝数和宿主的需求来选择ORI。

转录过程中RNA聚合酶的结合位点。

表达载体的重要组成部分，决定基因表达的细胞类型和获得的重组蛋白数量。

r：抗性基因，最常见的是：Amp（氨苄青霉素，常用）、Kan（卡那霉素，常用）、Tet（四环素，tet on/tet of）、Cmr（氯霉素，酵母表达质粒）、SM（链霉素）、Hyg（潮霉素，农杆菌）。

正确判断其抗性基因是培养发酵的必备因素。

pA：转录终止位点poly A。

报告基因：常见的copGFP（绿色荧光蛋白），Puro（嘌呤霉素），Lacz（乳糖操纵子）等等。

和抗性基因不同，报告基因不在大肠杆菌扩增质粒的过程中起作用，而是在质粒转入表达体系后起到作用的，为了显示过表达或是敲减的基因是否正常运作。

部分报告基因会融合在蛋白中表达，部分用独立的启动子进行表达。

第三步，看多克隆位点

第一点，酶切位点边标注了*的一般是指并不仅仅存在一个位点，也就不能用来作为构建质粒的酶切位点。

第二点，有的酶切位点，在序列中只有一个，但它上面也会标注一个*或者（dam），这说明可能这个酶切位点会有CpG岛的甲基化修饰。

如果必须使用该酶切位点，就需要用非甲基化的感受态细胞，如JM109或者JM110。

第四步，看多克隆位点的序列

多克隆位点一般会有上图这样的序列，也就是三联体密码加上酶切位点标示的序列。

其中三联体密码，主要是提示插入的表达的片段需要按照三联体进行插入。

若5`末端有差异，可以把基因的ATG（甲硫氨酸）的5`末端替换1-2个碱基（变成GTG或者GCG这样），从第二个氨基酸序列开始完全一致即可。

今天的图谱就教大家认识到这里，明天菌菌将继续教各位萌新学习构建质粒，你们准备好了吗？

标签：基因dNa