一、目的要求

学习果蔬组织中过氧化氢含量的测定原理和方法。

二、基本原理

果蔬体内积累的H2O2可以直接或间接地导致细胞膜脂质过氧化损害，加速细胞的衰老和解体。

但是，在受到病原菌侵染或受到不良环境胁迫时，果蔬体内迅速积累的H2O2参与果蔬抗病性和抗逆性启动和诱导过程。

因此，了解果蔬组织中H2O2的代谢具有十分重要的意义。

H2O2与四氯化钛（或硫酸钛）反应生成的过氧化物-钛复合物黄色沉淀，溶解于H2SO4后，可在波长412 nm处比色测定。

在一定范围内，其颜色深浅与H2O2浓度呈线性关系。

三、材料、仪器及试剂

（一）材料

苹果、番茄、芒果、桃等。

（二）仪器及用具

研钵、移液器、容量瓶（100 mL）、离心管、试管、高速冷冻离心机、分光光度计、通风橱。

（三）试剂

1．-20℃预冷丙酮

2．浓氨水

3．2 mol/L硫酸

取10 mL浓硫酸，稀释到90 mL。

4．10%（v/v）四氯化钛-盐酸溶液

在通风厨中，将10 mL四氯化钛，缓慢加入到90 mL盐酸中。

轻轻地在操作台上平摇，使四氯化钛充分溶解。

将试剂转入到棕色瓶中，密闭、4℃保存。

5．100 μmol/L H2O2-丙酮试剂

取57 μL 30%分析纯H2O2，溶于重蒸水中，稀释，定容至100 mL，得10 mmol/L H2O2溶液。

取1 mL该溶液，溶于丙酮中，并用丙酮定容至100 mL，即为100 μmol/L H2O2-丙酮试剂。

四、实验步骤

（一）标准曲线的制作

取6支试管，编号，在通风厨中向各试管中加入表18所列各试剂。

在加入四氯化钛和浓氨水时，要直接加入到溶液中，以减少挥发损失和管壁附着损失。

表18．测定H2O2浓度绘制标准曲线各试剂加入量及操作程序

加入2 mol/L硫酸后，摇动，使沉淀完全溶解。

以0号管为参比调零，于波长412 nm处比色测定溶液的吸光度值。

以吸光度值为纵坐标，H2O2微摩尔数为横坐标，制作标准曲线。

（二）提取

称取5.0 g新鲜果蔬组织样品，加入5.0 mL预冷的丙酮，在通风厨中在冰浴条件下研磨成匀浆后，于12 000×g、4℃离心20 min，收集上清液即为样品提取液。

（三）测定

吸取1.0 mL样品提取液，按照与制作标准曲线相同的方法进行测定。

但是需用丙酮将离心得到的沉淀物反复洗涤2~3次，直到除去色素。

再向洗涤后的沉淀中加入3.0 mL 2 mol/L硫酸，待完全溶解后进行比色测定。

重复三次。

五、实验结果与计算

根据溶液吸光度值，从标准曲线上查处相应的过氧化氢的量，计算每克鲜重（FW）果蔬组织中过氧化氢的含量，表示为μmol/g FW。

计算公式：

式中：

C ——由标曲查得溶液中过氧化氢的量，μmol；

V ——样品提取液总体积，mL；

VS——吸取样品液体积，mL；

W ——样品重量，g。

六、注意事项

1．也可用5%硫酸钛代替10%四氯化钛进行实验。

在配制四氯化钛溶液时，一定要在通风橱中小心仔细地进行操作。

2．在测定过程中滴加四氯化钛溶液和浓氨水时，要将它们直接滴加到试管内的溶液中，不能挂壁，然后迅速混匀。

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